Serangan terus-menerus dari penakluk Spanyol Don Nuño Beltrán de Guzmán ke tanah barat negara itu, untuk meningkatkan kekuasaan dan kekuasaannya atas wilayah-wilayah tersebut, menghasilkan pembentukan provinsi baru yang disebut Kerajaan Galicia Baru.
Wilayah tersebut dihuni oleh berbagai kelompok masyarakat adat, yang terus menerus memporak-porandakan pemukiman yang didirikan Spanyol di dalamnya. Letnan Nuño de Guzmán, Kapten Juan B. de Oñate menerima perintah untuk menenangkan provinsi-provinsi tersebut dan untuk mendirikan Villa de Guadalajara di tempat yang disebut Nochistlán, sebuah fakta yang ia lakukan pada tanggal 5 Januari 1532. Mengingat seringnya penduduk asli menyerang kota tersebut dia harus pindah setahun kemudian ke Tonalá dan kemudian ke Tlacotlán. Pemindahan ketiga dilakukan untuk menyelesaikan kota di Lembah Atemajac, tempat kota itu didirikan pada tanggal 14 Februari 1542 dengan kehadiran Cristóbal de Oñate sebagai gubernur New Galicia dan Don Antonio de Mendoza, kemudian raja muda Spanyol Baru, yang mengangkat walikota Miguel de Ibarra dan wakil gubernur.
Kota ini berkembang pesat dan mulai bersaing dengan Compostela (sekarang Tepic), yang pada waktu itu merupakan pusat kekuasaan agama dan sipil, sehingga penduduk Guadalajara memberikan tekanan seperti itu kepada otoritas Audiencia, sehingga raja Felipe II memutuskan untuk mengeluarkan Sertifikat bertanggal 10 Mei 1560 sehingga dia akan pindah dari Compostela ke Guadalajara, Katedral, Pengadilan Kerajaan, dan pejabat Departemen Keuangan.
Struktur perkotaan direncanakan sesuai dengan kota kolonial lainnya, sehingga tata letaknya dikembangkan dalam bentuk papan catur dari apa yang disebut alun-alun San Fernando. Kemudian lingkungan Mexicaltzingo dan Analco didirikan oleh Fray Antonio de Segovia, dan lingkungan Mezquitán, salah satu yang tertua. Rumah balai kota juga didirikan, di seberang kuil San Agustín saat ini dan gereja paroki pertama tempat Istana Keadilan berada.
Saat ini, kota yang megah, yang subur dalam bangunan kolonial, memamerkan sejumlah contoh arsitektur yang relevan, seperti Katedralnya, situs yang harus dilihat, dibangun antara tahun 1561 dan 1618 oleh arsitek Martín Casillas. Gayanya telah diklasifikasikan sebagai barok yang baru jadi. Strukturnya yang kokoh menjulang di depan Plaza de Guadalajara yang sekarang, dengan menara-menara anehnya yang, meskipun tidak termasuk gaya asli bangunan tersebut, saat ini diakui sebagai simbol ibu kota Guadalajara. Menara primitif dihancurkan pada abad ke-19 oleh gempa bumi, itulah mengapa menara yang dimilikinya saat ini ditambahkan. Bagian dalam candi bergaya semi Gotik, termasuk kubahnya yang terbuat dari renda.
Daerah keagamaan lain dari abad ke-16 adalah biara San Francisco, didirikan pada tahun 1542 di dekat sungai, di lingkungan Analco, dan hampir hancur total dalam Reformasi. Kuilnya, direnovasi pada akhir abad ke-17, dengan façade barok dari garis-garis Solomon yang sederhana, masih dipertahankan. Biara San Agustín, didirikan pada tahun 1573 oleh Royal Ordinance of Felipe II dan saat ini mempertahankan kelentengnya dengan fasad garis Herrerian yang parah dan interiornya dengan kubah berusuk.
Santa María de Gracia, yayasan biara lainnya, ditempati oleh para biarawati Dominika dari Puebla, dibangun pada tahun 1590 di depan Plaza de San Agustín dan dibayar oleh Hernán Gómez de la Peña. Konstruksi tersebut menempati enam blok, meskipun saat ini hanya pelipisnya yang bertahan, dengan fasad neoklasik dari paruh kedua abad ke-18.
